融合基因pCEAcd-tk/前体药物体系的体外旁观者效应的差异性
作者：郭语彬 伍新尧 罗超权 郭俊明 许道松 刘敏
单位：郭语彬 伍新尧 罗超权 郭俊明 许道松 刘敏(中山医科大学生化教研室 广州 510080)
关键词：自杀基因；旁观者效应；基因治疗；5-氟胞嘧啶；丙氧鸟苷
中国肿瘤生物治疗杂志000113 摘 要 目的： 探讨融合自杀基因pCEAcd-tk在导入到肺癌细胞后，其体外旁观者效应的细胞差异性。方法： 融合基因pCEAcd-tk提取后，脂质体介导的方法转染到6种肺癌细胞株(SPCA-1，GLC-82，A549，SC，HLAMP，L-78)，用MTT法测定在细胞转染前后对前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和丙氧鸟苷(GCV)的敏感性和在体外的旁观者效应。结果： ① 脂质体介导的基因转染效率很低。② 在6种已转染的肺癌细胞株中，有2种肺癌细胞株(SPCA-1，A549)对前体药物5-FC和GCV有较高的敏感性；③ 旁观者效应显示，2种细胞株(SPCA-1，SC)有强的体外旁观者效应，1种细胞株(A549)有较强的旁观者效应，而另外3种细胞株(GLC-82，HLAMP和L-78)的旁观者效应较差。结论： 不同的细胞在转染了融合自杀基因以后，其体外旁观者效应存在较大的差异。
, http://www.100md.com
《中国图书资料分类法》分类号 Q344.13
Variation of Bystander Effect of E coli. CD/HSV1-tk and Prodrugs System in vitro
Guo Yubin, Wu Xinyao, Luo Chaoquan， Guo Junming, Xu Daosong, Liu Min
(Department of Biochemistry, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080)
Abstract Objective: To investigate the variation in vitro bystander effect among human lung cancer cell lines after transfection of pCEAcd-tk. Methods: pCEAcd-tk was extracted and transfected to six human lung cancer cell lines. Their sensitivity to 5-fluorocytosine (5-FC) and ganciclovir (GCV) was measured by MTT assay. Their bystander effect was also determined. Results: 1. The efficiency of lipid mediated gene transfer was very low; 2. Two out of six human lung cancer cell lines(SPCA-1，A549) have a high sensitivity to 5-FC and GCV; 3.Bystander effect: Two out of six human cancer cell lines(SPCA-1，SC) have a good bystander effect, and one out of them(A549)has a intermediate bystander effect, but three out of them (GLC-82，HLAMP and L-78)have a poor bystander effect. Conclusion： There are a variation in vitro bystander effect in six human lung cancer cell lines after transfected with pCEAcd-tk.
, 百拇医药
Key words suicide gene; bystander effect; gene therapy; 5-fluorocytosine; ganciclovir
自杀基因/前体药物体系治疗恶性肿瘤有一个很大的优势就是存在旁观者效应，不仅转染了自杀基因的肿瘤细胞在运用前体药物后被杀死，且没有被转染的肿瘤细胞也被杀死。这种旁观者效应显著地扩大了自杀基因杀伤肿瘤细胞的能力，在一定程度上弥补了当前基因转染效率低的问题。Sturtz[1]报道转染了胸苷激酶(tk)基因的7种神经胶质瘤细胞对前体药物GCV的敏感性不一样，那么旁观者效应是否存在细胞差异性？本研究选用我们前期构建的融合自杀基因pCEAcd-tk的表达体系转染到6种肺癌细胞株，对此进行了研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 细胞株、质粒表达体系及主要试剂
, 百拇医药
人肺腺癌细胞株GLC-82，SPCA-1；人肺鳞癌细胞株L-78，SC；人小细胞肺癌A549及人肺巨细胞癌HLAMP分别来自本校动物中心及上海细胞生物研究所。培养6种肺癌细胞株，收集1×107个细胞，融合自杀基因的表达体系pCEAcd-tk，是由癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)基因启动子驱动的大肠肝菌胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase， CD)和Ⅰ型单纯疮疹病毒胸苷激酶(thymidine kinase, tk)融合基因。
1.2 质粒的提取与转染
用Qiagen的试剂制备质粒pCEAcd/tk，紫外分光光度计测量其A260/A280比值在1.80～2.00，用内切酶消化，电泳鉴定为融合自杀基因pCEAcd/tk的表达体系再转染肺癌细胞株。转染的前1天分别接种5×105个细胞在35 mm的培养板上，待细胞的密度为50%时进行转染，转染方法按ESCORT说明书进行，根据细胞对G418的敏感性不同加入含不同浓度的G418(0.21～1.0 mg/ml)的选择培养基，筛选约10～14 d，直到出现阳性克隆。在倒置显微镜(O1ympus公司产品)下计数细胞集落。
, 百拇医药
1.3 细胞毒性实验
取生长良好的在转染前与转染后的以上6种细胞株，胰酶消化后计数，加入到96孔平底培养板，每孔加入3×103个细胞，37℃，5%CO2孵箱中培养24 h以后，分别加入不同浓度的5-FC和GCV，每一剂量组设4个孔，设立不加前体药物的对照孔，37℃孵箱继续培养6 d，MTT法测量各孔的光密度OD值，根据下列公式计算细胞生长抑制率：
1.4 体外旁观者效应观察
取生长良好转染了融合基因的6种肺癌细胞与未转染的同类细胞按2∶8的比例混合(20%)，接种在96孔平底培养板中，每孔3×103个细胞，按以上方法加入不同浓度的前体药物5-FC和GCV，培养6 d后，MTT法测定各孔OD值，根据上述公式计算细胞生长抑制率。
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1.5 统计方法
寇氏法计算出每种细胞株在转染前的IC50，转染后的IC50及转染细胞占细胞总数的20%时(旁观者效应)的IC50。
2 结 果
2.1 pCEAcd/tk转染6种肺癌细胞株效率的比较
在脂质体ESCORT用量(15 μl)，质粒pCEAcd/tk的用量(l μg/μl,5 μl)，接种细胞的密度为5×105/35 mm及pCEAcd/tk-ESCORT与细胞的孵育时间均为6 h等相同的条件下，质粒pCEAcd/tk转染到6种肺癌细胞内并获稳定表达的细胞阳性克隆数见表1。
表1 pCEAcd-tk转染肺癌细胞株的效率比较
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Tab.1 Comparison of efficiency pCEAcd-tk transfected to
different lung cancer cell lines Cell lines
Number of posittive clones
(5×105cells)
Cell doubling time
(hours)
HLAMP
121
18
, 百拇医药
A549
118
22
GLC-82
34
27
SPCA-1
33
26
L-78
13
29
SC
, http://www.100md.com
2
35
从表1可知，脂质体介导的质粒pCEAcd-tk表达体系的转染效率很低，还不到1%，各细胞株之间的转染效率也存在较大差异，经G418筛选后的细胞阳性克隆数与细胞群体倍增时间成反比。由此可见，脂质体介导的质粒的转染效率与细胞的生理状态相关。
2.2 转染前、后的各肺癌细胞株对前体药物的敏感性
转染前的6种肺癌细胞株对前体药物5-FC和GCV的敏感性均较低，其IC50分别在(400～11 000) μmol/L和(80～1 100) μmol/L之间；而转染后其敏感性提高，其IC50分别降低到(4～220) μmol/L和(0.9～50) μmol/L之间，二者之比见表2。表2 六种肺癌细胞株在转染前与转染后对5-FC和GCV的敏感性
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Tab. 2 Sensitivity of six lung cancer cell lines to prodrugs 5-FC and GCV after transfection Cell lines
IC50(μmol/L)
Ratio of IC50△
Sensitivity
5-FC
GCV
5-FC
GCV
A549
, 百拇医药
1054.1
210.8
A549/cd-tk
4.6
0.9
229.2
234.2
high
SPCA-1
649.9
129.9
SPCA-1/cd-tk
, 百拇医药
5.2
1.0
124.9
120.9
high
SC
10183.6
2036.6
SC-cd-tk
215.2
43.0
47.3
47.4
, 百拇医药
intermediate
GLC-82
10688.8
1044.58
GLC-82/cd-tk
220.2
44.1
48.5
23.7
intermediate
L-78
1238.5
, http://www.100md.com
247.7
L-78/cd-tk
142.2
28.4
8.7
8.7
low
HLAMP
419.7
83.9
HLAMP/cd-tk
10.8
46.1
, 百拇医药
38.9
1.8
low
△ IC50 of wild-type cells/IC50 of transfected cells to 5-FC or GCV 表2可见，在转染pCEAcd-tk以后的A549和SPCA-1对5-FC和GCV的敏感性提高了120～234倍，SC和GLC-82提高了23～48倍；而L-78和HLAMP在转染以后对5-FC和GCV的敏感性仅提高了1～38倍。
2.3 体外旁观者效应
据预实验及Freeman[3]等报道，有20%的肿瘤细胞表达tk基因就能观察到明显的旁观者效应。故我们选用20%的转染细胞与80%的未转染细胞混合，加入前体药物5-FC和GCV后，根据IC50的变化来估计旁观者效应的差异，结果见表3。如IC50降低了20倍以上，认为有强旁观者效应；如降低5～20倍认为有中度的旁观者效应；5倍以下认为有弱的旁观者效应。
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表3 转染pCEAcd-tk的6种肺癌细胞株旁观者效应的差异
Tab.3 Bystander effect of six lung cancer cell lines stably transfected with the pCEAcd-tk Cell lines
IC50(μmol/L)
Ratio of IC50△
Likelihood of a
bystander effect
5-FC
GCV
, 百拇医药
5-FC
GCV
SPCA-1
649.9
129.9
SPCA-1/cd-tk(20%)
26.5
5.3
24.5
24.5
high
SC
10183.6
, 百拇医药
2036.6
SC/cd-tk(20%)
361.3
72.3
28.2
28.2
high
A549
1054.1
210.8
A549-/cd-tk(20%)
187.5
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37.5
5.6
5.6
intermediate
GLC-82
10688.8
1044.5
GLC-82/cd-tk(20%)
808.9
161.8
13.2
1.3
, 百拇医药
low
L-78
1238.5
247.7
L-78/cd-tk(20%)
781.5
156.3
1.6
1.6
low
HLAMP
419.7
83.9
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HLAMP/cd-tk(20%)
198.6
59.7
2.1
1.4
low
△ IC50 of wild-type cells/IC50 of 20% transfected cells 从表3可见，SPCA-1和SC表现出强的旁观者效应，A549表现出中度的旁观者效应，而有3株细胞(GLC-82，L-78和HLAMP)表现出弱的旁观者效应。因此,融合基因pCEAcd-tk的旁观者效应存在细胞差异性。
3 讨 论
, 百拇医药
目前，自杀基因旁观者效应的机理不是很清楚。Mesnil[4]认为tk基因的旁观者效应是前体药物的代谢产物(如磷酸化的GCV)通过细胞间的通信连接从转染的细胞传递到未转染的细胞，而Freeman[3]则认为是由转染细胞凋亡以后，释放凋亡小体，邻近的未转染的细胞吞噬凋亡小体而继发凋亡。不论如何，旁观者效应是自杀基因治疗肿瘤的一种很重要的现象，有必要对产生旁观者效应的机理进行深入的研究。从本实验结果看来，细胞本身对自杀基因/前体药物体系的旁观者效应存在较大的差异，这种差异的机理不清楚，Vrionis[5]发现HSV-tk基因的旁观者效应的差异与细胞之间的缝隙连接通信有关。所以在研究旁观者效应之时，有必要对这种差异进行筛选，选出能产生最佳旁观者效应的细胞株，才可开展下一步的研究工作。
实验计划对pCEAcd-tk表达体系产生旁观者效应的机理进行研究，主要采用的实验对象为肺癌细胞株。6株肺癌细胞中，在A549，SPCA-1，GLC-82及SC均有CEA表达；而在HLAMP和L-78细胞株中，未检测到CEA。从本实验结果可见，脂质体介导的由CEA启动子驱动的融合基因cd-tk的转染效率与细胞的群体倍增时间呈负相关。
, 百拇医药
总之，基因的转染效率和表达效率，细胞本身对自杀基因-前体药物的敏感性及旁观者效应的差异，这些因素相互作用可影响pCEAcd-tk前体药物体系杀伤肿瘤细胞的能力。如能提高基因的转染效率，利用肿瘤细胞对pCEAcd-tk/5-FC—GCV体系有较高的敏感性以及有很好的旁观者效应，才会对肿瘤细胞有很好的杀伤效应。
参 考 文 献
1，Sturtz FG, Weddell K, Shulok J， et al. Variable efficiency of the thymidine kinase/Ganciclovir system in human glioblastoma cell lines: Implications for gene therapy. Hum Gene Ther, 1997, 8: 1945
2，Daosong Xu, Xinyao Wu, Xunfei X， et al. Targeted therapy of CEA-producing cells by combination of E coli. CD/HSV1-tk fusion gene and radiation. Gene Ther Mol Biol, 1998， 3: 113
, http://www.100md.com
3，Freeman SM, Aboud CN, Whartenby KA, et al. The bystander effect: Tumor regression when a fraction of the famor mass is genetically modified. Cancer Res, 1993, 53: 5274
4，Mesnil MP, Tiraby G, Willecke K, et al. Bystander killing of cancer cells by HSV-tk is mediated by connexins. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 1831
5，Vrionis FD, Wu TK, Qi P， et al. The bystander effect exerted by tumor cells expressing the HSV-tk gene is dependent on connexin expression and cell communication via gap junctions. Gene Therapy， 1997， 4: 577
(1999-04-08收稿； 1999-09-16修回), 百拇医药
单位：郭语彬 伍新尧 罗超权 郭俊明 许道松 刘敏(中山医科大学生化教研室 广州 510080)
关键词：自杀基因；旁观者效应；基因治疗；5-氟胞嘧啶；丙氧鸟苷
中国肿瘤生物治疗杂志000113 摘 要 目的： 探讨融合自杀基因pCEAcd-tk在导入到肺癌细胞后，其体外旁观者效应的细胞差异性。方法： 融合基因pCEAcd-tk提取后，脂质体介导的方法转染到6种肺癌细胞株(SPCA-1，GLC-82，A549，SC，HLAMP，L-78)，用MTT法测定在细胞转染前后对前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和丙氧鸟苷(GCV)的敏感性和在体外的旁观者效应。结果： ① 脂质体介导的基因转染效率很低。② 在6种已转染的肺癌细胞株中，有2种肺癌细胞株(SPCA-1，A549)对前体药物5-FC和GCV有较高的敏感性；③ 旁观者效应显示，2种细胞株(SPCA-1，SC)有强的体外旁观者效应，1种细胞株(A549)有较强的旁观者效应，而另外3种细胞株(GLC-82，HLAMP和L-78)的旁观者效应较差。结论： 不同的细胞在转染了融合自杀基因以后，其体外旁观者效应存在较大的差异。
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《中国图书资料分类法》分类号 Q344.13
Variation of Bystander Effect of E coli. CD/HSV1-tk and Prodrugs System in vitro
Guo Yubin, Wu Xinyao, Luo Chaoquan， Guo Junming, Xu Daosong, Liu Min
(Department of Biochemistry, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080)
Abstract Objective: To investigate the variation in vitro bystander effect among human lung cancer cell lines after transfection of pCEAcd-tk. Methods: pCEAcd-tk was extracted and transfected to six human lung cancer cell lines. Their sensitivity to 5-fluorocytosine (5-FC) and ganciclovir (GCV) was measured by MTT assay. Their bystander effect was also determined. Results: 1. The efficiency of lipid mediated gene transfer was very low; 2. Two out of six human lung cancer cell lines(SPCA-1，A549) have a high sensitivity to 5-FC and GCV; 3.Bystander effect: Two out of six human cancer cell lines(SPCA-1，SC) have a good bystander effect, and one out of them(A549)has a intermediate bystander effect, but three out of them (GLC-82，HLAMP and L-78)have a poor bystander effect. Conclusion： There are a variation in vitro bystander effect in six human lung cancer cell lines after transfected with pCEAcd-tk.
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Key words suicide gene; bystander effect; gene therapy; 5-fluorocytosine; ganciclovir
自杀基因/前体药物体系治疗恶性肿瘤有一个很大的优势就是存在旁观者效应，不仅转染了自杀基因的肿瘤细胞在运用前体药物后被杀死，且没有被转染的肿瘤细胞也被杀死。这种旁观者效应显著地扩大了自杀基因杀伤肿瘤细胞的能力，在一定程度上弥补了当前基因转染效率低的问题。Sturtz[1]报道转染了胸苷激酶(tk)基因的7种神经胶质瘤细胞对前体药物GCV的敏感性不一样，那么旁观者效应是否存在细胞差异性？本研究选用我们前期构建的融合自杀基因pCEAcd-tk的表达体系转染到6种肺癌细胞株，对此进行了研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 细胞株、质粒表达体系及主要试剂
, 百拇医药
人肺腺癌细胞株GLC-82，SPCA-1；人肺鳞癌细胞株L-78，SC；人小细胞肺癌A549及人肺巨细胞癌HLAMP分别来自本校动物中心及上海细胞生物研究所。培养6种肺癌细胞株，收集1×107个细胞，融合自杀基因的表达体系pCEAcd-tk，是由癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)基因启动子驱动的大肠肝菌胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase， CD)和Ⅰ型单纯疮疹病毒胸苷激酶(thymidine kinase, tk)融合基因。
1.2 质粒的提取与转染
用Qiagen的试剂制备质粒pCEAcd/tk，紫外分光光度计测量其A260/A280比值在1.80～2.00，用内切酶消化，电泳鉴定为融合自杀基因pCEAcd/tk的表达体系再转染肺癌细胞株。转染的前1天分别接种5×105个细胞在35 mm的培养板上，待细胞的密度为50%时进行转染，转染方法按ESCORT说明书进行，根据细胞对G418的敏感性不同加入含不同浓度的G418(0.21～1.0 mg/ml)的选择培养基，筛选约10～14 d，直到出现阳性克隆。在倒置显微镜(O1ympus公司产品)下计数细胞集落。
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1.3 细胞毒性实验
取生长良好的在转染前与转染后的以上6种细胞株，胰酶消化后计数，加入到96孔平底培养板，每孔加入3×103个细胞，37℃，5%CO2孵箱中培养24 h以后，分别加入不同浓度的5-FC和GCV，每一剂量组设4个孔，设立不加前体药物的对照孔，37℃孵箱继续培养6 d，MTT法测量各孔的光密度OD值，根据下列公式计算细胞生长抑制率：
1.4 体外旁观者效应观察
取生长良好转染了融合基因的6种肺癌细胞与未转染的同类细胞按2∶8的比例混合(20%)，接种在96孔平底培养板中，每孔3×103个细胞，按以上方法加入不同浓度的前体药物5-FC和GCV，培养6 d后，MTT法测定各孔OD值，根据上述公式计算细胞生长抑制率。
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1.5 统计方法
寇氏法计算出每种细胞株在转染前的IC50，转染后的IC50及转染细胞占细胞总数的20%时(旁观者效应)的IC50。
2 结 果
2.1 pCEAcd/tk转染6种肺癌细胞株效率的比较
在脂质体ESCORT用量(15 μl)，质粒pCEAcd/tk的用量(l μg/μl,5 μl)，接种细胞的密度为5×105/35 mm及pCEAcd/tk-ESCORT与细胞的孵育时间均为6 h等相同的条件下，质粒pCEAcd/tk转染到6种肺癌细胞内并获稳定表达的细胞阳性克隆数见表1。
表1 pCEAcd-tk转染肺癌细胞株的效率比较
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Tab.1 Comparison of efficiency pCEAcd-tk transfected to
different lung cancer cell lines Cell lines
Number of posittive clones
(5×105cells)
Cell doubling time
(hours)
HLAMP
121
18
, 百拇医药
A549
118
22
GLC-82
34
27
SPCA-1
33
26
L-78
13
29
SC
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2
35
从表1可知，脂质体介导的质粒pCEAcd-tk表达体系的转染效率很低，还不到1%，各细胞株之间的转染效率也存在较大差异，经G418筛选后的细胞阳性克隆数与细胞群体倍增时间成反比。由此可见，脂质体介导的质粒的转染效率与细胞的生理状态相关。
2.2 转染前、后的各肺癌细胞株对前体药物的敏感性
转染前的6种肺癌细胞株对前体药物5-FC和GCV的敏感性均较低，其IC50分别在(400～11 000) μmol/L和(80～1 100) μmol/L之间；而转染后其敏感性提高，其IC50分别降低到(4～220) μmol/L和(0.9～50) μmol/L之间，二者之比见表2。表2 六种肺癌细胞株在转染前与转染后对5-FC和GCV的敏感性
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Tab. 2 Sensitivity of six lung cancer cell lines to prodrugs 5-FC and GCV after transfection Cell lines
IC50(μmol/L)
Ratio of IC50△
Sensitivity
5-FC
GCV
5-FC
GCV
A549
, 百拇医药
1054.1
210.8
A549/cd-tk
4.6
0.9
229.2
234.2
high
SPCA-1
649.9
129.9
SPCA-1/cd-tk
, 百拇医药
5.2
1.0
124.9
120.9
high
SC
10183.6
2036.6
SC-cd-tk
215.2
43.0
47.3
47.4
, 百拇医药
intermediate
GLC-82
10688.8
1044.58
GLC-82/cd-tk
220.2
44.1
48.5
23.7
intermediate
L-78
1238.5
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247.7
L-78/cd-tk
142.2
28.4
8.7
8.7
low
HLAMP
419.7
83.9
HLAMP/cd-tk
10.8
46.1
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38.9
1.8
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△ IC50 of wild-type cells/IC50 of transfected cells to 5-FC or GCV 表2可见，在转染pCEAcd-tk以后的A549和SPCA-1对5-FC和GCV的敏感性提高了120～234倍，SC和GLC-82提高了23～48倍；而L-78和HLAMP在转染以后对5-FC和GCV的敏感性仅提高了1～38倍。
2.3 体外旁观者效应
据预实验及Freeman[3]等报道，有20%的肿瘤细胞表达tk基因就能观察到明显的旁观者效应。故我们选用20%的转染细胞与80%的未转染细胞混合，加入前体药物5-FC和GCV后，根据IC50的变化来估计旁观者效应的差异，结果见表3。如IC50降低了20倍以上，认为有强旁观者效应；如降低5～20倍认为有中度的旁观者效应；5倍以下认为有弱的旁观者效应。
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表3 转染pCEAcd-tk的6种肺癌细胞株旁观者效应的差异
Tab.3 Bystander effect of six lung cancer cell lines stably transfected with the pCEAcd-tk Cell lines
IC50(μmol/L)
Ratio of IC50△
Likelihood of a
bystander effect
5-FC
GCV
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5-FC
GCV
SPCA-1
649.9
129.9
SPCA-1/cd-tk(20%)
26.5
5.3
24.5
24.5
high
SC
10183.6
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2036.6
SC/cd-tk(20%)
361.3
72.3
28.2
28.2
high
A549
1054.1
210.8
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187.5
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5.6
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intermediate
GLC-82
10688.8
1044.5
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808.9
161.8
13.2
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L-78
1238.5
247.7
L-78/cd-tk(20%)
781.5
156.3
1.6
1.6
low
HLAMP
419.7
83.9
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HLAMP/cd-tk(20%)
198.6
59.7
2.1
1.4
low
△ IC50 of wild-type cells/IC50 of 20% transfected cells 从表3可见，SPCA-1和SC表现出强的旁观者效应，A549表现出中度的旁观者效应，而有3株细胞(GLC-82，L-78和HLAMP)表现出弱的旁观者效应。因此,融合基因pCEAcd-tk的旁观者效应存在细胞差异性。
3 讨 论
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目前，自杀基因旁观者效应的机理不是很清楚。Mesnil[4]认为tk基因的旁观者效应是前体药物的代谢产物(如磷酸化的GCV)通过细胞间的通信连接从转染的细胞传递到未转染的细胞，而Freeman[3]则认为是由转染细胞凋亡以后，释放凋亡小体，邻近的未转染的细胞吞噬凋亡小体而继发凋亡。不论如何，旁观者效应是自杀基因治疗肿瘤的一种很重要的现象，有必要对产生旁观者效应的机理进行深入的研究。从本实验结果看来，细胞本身对自杀基因/前体药物体系的旁观者效应存在较大的差异，这种差异的机理不清楚，Vrionis[5]发现HSV-tk基因的旁观者效应的差异与细胞之间的缝隙连接通信有关。所以在研究旁观者效应之时，有必要对这种差异进行筛选，选出能产生最佳旁观者效应的细胞株，才可开展下一步的研究工作。
实验计划对pCEAcd-tk表达体系产生旁观者效应的机理进行研究，主要采用的实验对象为肺癌细胞株。6株肺癌细胞中，在A549，SPCA-1，GLC-82及SC均有CEA表达；而在HLAMP和L-78细胞株中，未检测到CEA。从本实验结果可见，脂质体介导的由CEA启动子驱动的融合基因cd-tk的转染效率与细胞的群体倍增时间呈负相关。
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总之，基因的转染效率和表达效率，细胞本身对自杀基因-前体药物的敏感性及旁观者效应的差异，这些因素相互作用可影响pCEAcd-tk前体药物体系杀伤肿瘤细胞的能力。如能提高基因的转染效率，利用肿瘤细胞对pCEAcd-tk/5-FC—GCV体系有较高的敏感性以及有很好的旁观者效应，才会对肿瘤细胞有很好的杀伤效应。
参 考 文 献
1，Sturtz FG, Weddell K, Shulok J， et al. Variable efficiency of the thymidine kinase/Ganciclovir system in human glioblastoma cell lines: Implications for gene therapy. Hum Gene Ther, 1997, 8: 1945
2，Daosong Xu, Xinyao Wu, Xunfei X， et al. Targeted therapy of CEA-producing cells by combination of E coli. CD/HSV1-tk fusion gene and radiation. Gene Ther Mol Biol, 1998， 3: 113
, http://www.100md.com
3，Freeman SM, Aboud CN, Whartenby KA, et al. The bystander effect: Tumor regression when a fraction of the famor mass is genetically modified. Cancer Res, 1993, 53: 5274
4，Mesnil MP, Tiraby G, Willecke K, et al. Bystander killing of cancer cells by HSV-tk is mediated by connexins. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 1831
5，Vrionis FD, Wu TK, Qi P， et al. The bystander effect exerted by tumor cells expressing the HSV-tk gene is dependent on connexin expression and cell communication via gap junctions. Gene Therapy， 1997， 4: 577
(1999-04-08收稿； 1999-09-16修回), 百拇医药